分子實驗之如何保證樣本核酸穩定？

科研狗起早摸黑做了幾天分子克隆實驗，

本想著拖了好幾個星期的實驗終于要做完啦！瞬間覺得自己棒棒噠！

但是最后看實驗結果！！！ 原地裂開

排查實驗試劑，沒問題！

排查實驗操作，沒問題！

排查儀器，沒問題！

那么問題到底出在哪呢？

其實問題有可能出現在樣本保存與前處理步驟中哦。生物樣本中的核酸(DNA/RNA)會因為核酸酶、溫度、pH值、微生物、自身化學性質等因素而發生被動或主動降解，從而導致分子實驗結果不盡人意。目前針對不同科研的需求，更多的樣本保存方式也相繼問世，小愛為大家匯總了各類樣本保存的步驟、注意事項、以及樣本保存耗材或保存液的推薦。

一、實驗樣本主要類型：

分子實驗中主要的樣本類型有：純核酸類、組織類、細胞類及環境類。不同樣本具有不同的保存方式以及操作注意事項。

圖1 常見的實驗樣本類型

表1 不同類型樣本核酸保存方法及穩定性

二、實驗樣本前處理步驟及注意事項

1、組織樣本：

塊狀組織樣本短時間內無法充分裂解，一般需要進行樣本預處理。組織取材在組織離體30min內完成，取樣的動作要盡量快速利索，將組織按任一方向切成黃豆粒大小。

組織DNA提取：新鮮組織樣本用生理鹽水清洗2次，即刻進行實驗。如若不立即進行實驗，可用液氮速凍，-80℃凍存。

組織RNA提取：將動物或植物組織切成小塊，在液氮中磨碎或用勻漿器勻漿處理,快速轉入裝有1mL Trizol(abs60154)的2mL離心管中，立即進行實驗。若后期再進行實驗，盡量保存時將樣本浸入RNA樣品保存液(abs9268)后置4℃冰箱過夜（4℃過夜是必需的，這樣可使RNA樣品保存液滲入到組織中），然后轉移到-20℃冰箱。或者液氮研磨組織，加入Trizol，放入-80℃保存。

圖2 組織樣本RNA提取流程圖

2、細胞樣本：

DNA提取：細胞收集沉淀后，進行液氮速凍，-80℃保存。

RNA提取：

1）貼壁細胞：吸盡培養液，每10cm²培養面積加入1mL Trizol，用加樣器吹打數次，以確保細胞裂解，然后轉移至離心管中。注：貼壁細胞Trizol的使用量應由培養皿表面積決定，而非由細胞數目決定。Trizol量不足可能導致提取的RNA中有DNA污染；
2）懸浮細胞：離心收集細胞，吸盡液體，每5-10×10⁶動植物或酵母細胞，或每1×10⁷細菌細胞加入1mL Trizol，用加樣器吹打，使其裂解，然后轉移至離心管中。 注：添加Trizol前切勿洗滌細胞，以免RNA降解。必要時可以用勻漿器來裂解某些細菌或者酵母細胞。若后期再進行RNA提取實驗，細胞用液氮速凍，-80℃凍存。

3、血液樣本：

采用含有抗凝劑的真空采血管保存即可。但采血管中的抗凝劑種類多樣，抗凝劑的種類也會直接影響后續檢測結果，面對這么多的采血管如何進行選擇？我們建議使用EDTA或枸櫞酸鈉抗凝管，不建議使用肝素抗凝管（因肝素在后面的核酸提取過程中很難去除，且肝素對PCR反應有很強的抑制作用，因此不建議使用肝素抗凝管）。采集完血液，顛倒混勻備用。另外冰凍血液溶解過程中會有破碎的細胞釋放RNA酶，因此在冰凍前加入Trizol，切勿直接凍存新鮮血液，保存好的血液應避免反復凍融。

4、血清/血漿樣本：

全血不加抗凝劑分離的上清是血清，加入抗凝劑分離的上清是血漿。取全血后，靜止1-2h，置于離心機3000rpm離心15min即可獲得血清或血漿。

三、樣本前處理利器—RNA樣品保存液(abs9268)

RNA樣品保存液是一種無毒的可直接使用的樣品儲存液，能使細胞內的RNA與RNA酶分離，防止樣本中RNA表達譜發生變化。加入樣本保存液的樣本中RNA在室溫可以保存7天，4℃可以保存4周，-20℃、-80℃標本可以長期保存。在RNA樣品保存液中保存的標本，反復凍融至室溫20次不影響RNA的質量。

操作步驟：

1）計算保存液用量：根據要保存的各樣本的體積，計算出所需RNA樣品保存液用量；a：RNA樣品保存液的用量應當是組織體積的10倍(100mg組織約用1mL RNA樣品保存液)；b：離心收集2×10⁷細胞RNA樣品保存液的用量是1mL；
2）分裝：將RNA樣品保存液按需要量分裝入自備保存管中；
3）切片：快速將較大的組織切成厚度＜0.5cm的任意片狀，較小的組織直接取下，立即浸入RNA樣品保存液中；
4）保存：保存時先將樣本浸入RNA樣品保存液后置4℃冰箱過夜，然后轉移到-20℃冰箱或繼續轉移至-80℃冰箱。

四、本期小愛產品推薦

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