疑難樣本 | FFPE樣本核酸提取指南

什么是FFPE樣本？

FFPE (Formalin Fixed Paraffin Embedded，福爾馬林固定石蠟包埋) 樣本是將細胞、組織等放到固定液中，將固定后的細胞、組織置入由液體石蠟填充的容器中進行保存的樣本，這樣處理能夠較長時間地保持細胞病理的原始狀態。

FFPE樣本可以用于常規的組織學分析，也可用于分子細胞的基因表達分析。FFPE樣本的基因檢測，指的就是利用FFPE樣本通過蒸餾、消化、DNA/RNA提取等細胞、組織分子技術，對樣本中DNA及RNA進行檢測，以獲取相關基因表達在細胞進行特定組織及生物過程中的功能及表型特征，為基因組學研究及深入了解腫瘤等領域研究具有很大的參考價值和應用場景價值。

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FFPE樣本制備及核酸提取流程

圖 FFPE樣本制備及核酸提取純化流程圖

1、樣本采集

快速從病人身上獲取組織樣本。為避免組織離體后在外界環境中可能發生基因改變、組織自溶等變化，組織從獲取到固定之間的時間間隔控制得越短越好。

2、組織固定

將獲得的組織置于一定濃度（一般是10%）的福爾馬林溶液中。福爾馬林的作用是用于組織固定，這個過程會使蛋白質之間、核酸之間、蛋白質和核酸之間發生一定程度的交聯。此過程要注意把握組織的厚度，固定的時間。

3、石蠟包埋

將組織用石蠟進行包埋。此過程包含：
1）脫水，使用醇類替換水；
2）透明，使用二甲苯替換掉醇類；
3）浸蠟，將組織浸入石蠟中，利用石蠟替換掉二甲苯；
4）包埋，將滲透后的組織樣本浸泡在液態石蠟中，連同包埋模具一起冰冷后固化，再切割為薄片后成為固定石蠟樣本，可長期保存或進行下游實驗。

4、核酸提取

FFPE樣本核酸提取的通用步驟為脫蠟、裂解-解交聯、純化、回收。具體步驟參照不同試劑盒說明書進行操作。

1）脫蠟

用手術刀片刮取玻片上的樣本至取樣管中，加入去蠟劑（環保浸蠟脫蠟透明液，abs9791）或二甲苯，在一定溫度中孵育進行脫蠟暴露組織。

2）裂解-解交聯

利用裂解液與蛋白酶在一定溫度下進行組織裂解與解交聯。

3）核酸純化

采用不同核酸純化方法純化DNA或者RNA。

4）回收核酸

利用洗脫液回收核酸。

圖 FFPE樣本核酸純化步驟

下面以愛必信的石蠟組織基因組DNA快速提取試劑盒(abs60019)為例具體介紹FFPE樣本DNA提取純化步驟。

1、產品組分信息：

2、自備材料

無水乙醇（第一次使用前請先在漂洗液 WB中加入適量無水乙醇，充分混勻）、2mL EP管、水浴鍋、離心機、渦旋儀

3、實驗步驟

1）將組織切片4-5片，裝入到2mL EP管中，加入1.5mL SLI液，充分振蕩；
2）65℃水浴30min，再次充分混勻，12000rpm，4℃離心15min；
3）棄上清，再加入1mL SLI液，按以上步驟重復2-3次；
4）沉淀（組織）加入200μL裂解液TL和1mL SLⅡ溶液，加入20-50μL蛋白酶K，56℃水浴過夜；
5）觀察組織消化情況，如還有組織未消化完，加入10-20μL蛋白酶K，56℃水浴10-20min或直至組織消化完（期間可用渦旋充分振蕩混勻加速組織消化）；

注：也可用二甲苯進行脫蠟，所需試劑需自備，具體操作步驟也可參考本試劑盒說明書—脫蠟方法二。

6）加入200μL結合液CB，立刻渦旋振蕩充分混勻，在70℃放置10min；
7）冷卻后加入200μL無水乙醇，立刻渦旋振蕩充分混勻，此時可能會出現絮狀沉淀；
8）將上一步混合物（包括可能有的沉淀）加入一個吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液；
9）加入500μL抑制物去除液IR，12000rpm離心30sec，棄廢液；
10）加入500μL漂洗液WB（請先檢查是否已加入無水乙醇！），12000rpm離心30sec，棄掉廢液；
11）重復操作步驟10；
12）將吸附柱AC放回空收集管中，12000rpm離心2min，將吸附柱置于室溫放置數分鐘，以晾干吸附材料中殘余的漂洗液，以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應；
13）取出吸附柱AC，放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加30-100μL洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在65℃水浴中預熱效果更好），室溫放置3-5min，12000rpm離心1min。為了增加DNA的回收率，可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2min，12000rpm離心1min。
注：DNA 產物應保存在-20℃，以防DNA降解。

5、核酸質控檢測

對于從FFPE樣本中提取的核酸，一般通過吸光度檢測儀器Nanodrop，熒光定量儀Qubit及毛細管電泳儀進行測定核酸濃度、OD值（純度）及片段大小(DIN)。對于核酸的質控是非常重要的，因為提取的核酸質量會影響下游的實驗結果。

本期產品推薦：

[1] Klopfleisch R, Weiss AT, Gruber AD. Excavation of a buried treasure--DNA, mRNA, miRNA and protein analysis in formalin fixed, paraffin embedded tissues. Histol Histopathol. 2011 Jun;26(6):797-810. doi: 10.14670/HH-26.797. PMID: 21472693.

[2] 裴永彬,賀新奇,趙增仁.石蠟包埋組織中DNA提取技術研究進展[J].河北醫科大學學報,2010,31(11):1396-1399.

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