邁安納｜【文獻分享】mRNA個性化腫瘤疫苗抗原優化的重要性

結直腸癌是癌癥死亡的第二大原因，早期結直腸癌可通過手術治療，但復發和耐藥性問題亟待解決。癌癥免疫治療通過激活患者自身免疫系統對抗惡性細胞，展現出革命性潛力。PCVs通過靶向患者特異性新抗原，誘導特異性抗腫瘤免疫反應，成為研究熱點。然而，新抗原的準確預測和疫苗設計的優化仍是主要挑戰。

近日，韓國加圖立大學Jae-Hwan Nam團隊在Advanced Science上發表名為“Rapid-Turnaround Co-Administration of mRNA-Based MHC-I and MHC-II-Restricted Neoantigens Enhances Immune Responses of Antigen-Specific CD8+ T Cells and Anti-Cancer Efficacy in Colorectal Cancer”的研究，闡述了抗原序列選擇的重要性。

Figure 1. Schematic illustration of neoantigen validation

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在常規個性化癌癥疫苗（PCV）新抗原設計中，通常通過靶向癌癥組織中的體細胞突變來設計表位。本研究利用MC38細胞系構建了一個原位模型，利用該細胞系與小鼠品系之間的基因組差異來誘導腫瘤特異性免疫反應（圖1a）。通過兩種變異檢測工具（variant callers）識別出僅存在于腫瘤中的變異，最終篩選出546個單核苷酸變異（SNVs）和68個插入/缺失（InDels）作為新抗原設計的候選序列。

此外，通過比較正常和腫瘤樣本的mRNA-seq數據，使用ARRIBA和STAR fusion工具分析了基因融合，最終確定了6個基因融合作為新抗原設計的候選序列。經過綜合考慮MHC結合能力、突變表達水平以及與自身抗原的獨特性，最終設計了20個MHC-I和12個MHC-II限制性新抗原。

為了評估預測新抗原的免疫原性，將32個具有高MHC-I和MHC-II結合預測評分的新抗原候選序列合成為合成長肽（SLPs）。其中，20個與MHC-I相關的新抗原被合成為8-10個氨基酸的肽，而12個與MHC-II相關的新抗原被合成為27個氨基酸的肽。這些肽與poly I:C混合后，每周一次皮下注射給C57BL/6小鼠。免疫后一周，收集脾細胞進行IFN-γ ELISpot分析。結果顯示，兩個MHC-I相關的新抗原（CNM-I-13和CNM-I-19）和兩個MHC-II相關的新抗原（CNM-II-01和CNM-II-10）表現出顯著的抗原特異性IFN-γ分泌（圖2a）。

隨后，構建了編碼相應新抗原的mRNA，并封裝在脂質納米顆粒（LNPs）中。將mRNA疫苗在0、4、7和14天皮下注射給C57BL/6小鼠。編碼MHC-II限制性新抗原的mRNA疫苗（CNM-II-01和CNM-II-04）顯著增加了IFN-γ分泌，而編碼MHC-I相關新抗原的mRNA疫苗在治療期間未誘導IFN-γ分泌（圖2b）。進一步構建了編碼長序列（27個氨基酸）MHC-I相關新抗原的mRNA疫苗，發現其比短序列（8-10個氨基酸）mRNA疫苗更具免疫原性（圖2c）。總體而言，通過計算機模擬方法預測的新抗原中，10%的MHC-I抗原和25%的MHC-II抗原表現出免疫原性（圖2d）。

流式細胞術分析證實，預測的MHC-I和MHC-II抗原途徑分別誘導了細胞因子分泌。MHC-I新抗原誘導了CD8+細胞特異性的IFN-γ和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）分泌，而MHC-II新抗原則促使CD4+細胞特異性的IFN-γ和TNF-α分泌（圖2e）。

Figure 2. Immunogenicity identification of predicted neoantigen candidates.

為了確定最小表位，設計了MHC-I抗原（CNM-I-13）內的10-mer肽（CNM-I-13-01至CNM-I-13-10）和MHC-II抗原（CNM-II-04）內的14-mer肽（CNM-II-04-01至CNM-II-04-13），包括每個突變（圖3a）。發現CNM-I-13-05、-06、-07和-08在MHC-I限制性抗原中具有高度免疫原性（圖3b），而CNM-II-04-09、-10、-11、-12和-13在MHC-II限制性抗原中強烈誘導抗原特異性IFN-γ分泌（圖3c）。

通過流式細胞術分析確認，聯合遞送MHC-I和MHC-II疫苗顯著增加了CD8+T細胞中IFN-γ或TNF-α的分泌，但在CD4+T細胞中未觀察到顯著差異（圖3f,g）。這些結果表明，聯合遞送MHC-I和MHC-II不僅觸發了各自的抗原特異性免疫反應，而且MHC-II抗原刺激的CD4+T細胞活化有助于抗原特異性CD8+T細胞的活化。

Figure 3. Defining the minimal epitopes for MHC-I and MHC-II neoantigens.

在MC38腫瘤小鼠模型中，分別給予MHC-I疫苗、MHC-II疫苗或兩者聯合疫苗，評估mRNA疫苗的抗癌效果（圖4a）。與磷酸鹽緩沖液（PBS）處理組相比，mRNA疫苗處理組顯著抑制了結腸腫瘤的生長和體積（圖4b-d）。聯合遞送MHC-I和MHC-II疫苗組無瘤小鼠數量顯著增加（3/6），高于單獨給予MHC-I（1/6）或MHC-II疫苗（0/6）組。此外，流式細胞術數據顯示，MHC-II疫苗處理組CD4+/CD8+T細胞數量顯著增加（圖4e）。聯合遞送MHC-I和MHC-II疫苗比單獨給予MHC-I疫苗誘導了更多的CD8+短壽命效應T細胞（SLECs，CD127-KLRG1+的CD8+細胞）增殖（圖4f）。所有疫苗處理組的調節性T細胞（Treg）增殖均顯著減少（圖4g）。

在腫瘤小鼠模型中，聯合遞送MHC-I和MHC-II疫苗組的抗原特異性CD8+T細胞分泌的IFN-γ和TNF-α水平顯著高于單獨給予MHC-I疫苗組，而CD4+T細胞的IFN-γ和TNF-α分泌水平在MHC-II疫苗處理組和聯合遞送組之間無顯著差異（圖4h）。

Figure 4. Co-administration with MHC-I and MHC-II-restricted neoantigens enhanced anti-cancer efficacy via cell-mediated immune responses

為了測試mRNA疫苗在預防腫瘤復發方面的效果，對腫瘤小鼠進行手術切除，并注射PBS或聯合遞送MHC-I和MHC-II mRNA疫苗（圖5a）。與PBS處理組相比，mRNA疫苗處理組腫瘤復發顯著減少（圖5b）。此外，通過每周一次給予PBS或MHC-I/MHC-II疫苗，持續三周，測試了預防性接種的抗癌效果。與對照組相比，接受mRNA基礎新抗原疫苗處理的小鼠腫瘤生長顯著減少，無瘤小鼠數量增加。IFN-γ ELISpot分析確認了預防性接種后新抗原特異性IFN-γ分泌，表明產生了強烈的免疫反應。

通過接種不同數量的MC38細胞（1×105至3×105個細胞）給C57BL/6小鼠，評估mRNA疫苗在不同癌癥發展階段的抗癌效果（圖5c-f）。與PBS處理組相比，疫苗處理組腫瘤體積和重量顯著減少，且在接種低劑量癌細胞的小鼠中抗腫瘤效果更顯著（圖5c-f）。特別是，mRNA疫苗處理組中有兩只小鼠無瘤（圖5e）。細胞毒性測定顯示，從mRNA疫苗處理小鼠中分離的腫瘤浸潤淋巴細胞（TILs）對MC38-luc結腸癌細胞的殺傷作用顯著增強。流式細胞術和免疫組化分析顯示，mRNA疫苗處理組腫瘤組織中CD8+T細胞數量顯著增加，且這些細胞浸潤腫瘤并影響腫瘤細胞死亡。

Figure 5. mRNA vaccine reduces tumor recurrence after surgery in a mouse colon cancer model and increase anti-cancer efficacy in early colon cancer development.

在MC38腫瘤小鼠模型中，分別在接種腫瘤細胞后的第1、4、7和11天給予主要mRNA疫苗接種，以確認基于接種時間的癌癥疫苗效果（圖6a）。與對照組相比，接種mRNA疫苗的小鼠腫瘤生長顯著抑制，且七只小鼠中有六只腫瘤消失（圖6b）。通過皮爾遜相關系數評估抗原特異性T細胞相關IFN-γ分泌與腫瘤大小之間的相關性，結果顯示負相關（r=-0.835，p<0.001）。流式細胞術分析T細胞耗竭標記物顯示，早期免疫組小鼠CD4+或CD8+T細胞中PD-1和Tim-3表達較低。隨著接種時間的延遲，CD4+或CD8+T細胞中Tim-3表達逐漸增加。這些結果表明，早期接種mRNA癌癥疫苗并與免疫檢查點抑制劑（ICIs）聯合治療對于有效的抗癌治療是必要的。

Figure 6. Early-stage vaccination produces a robust anti-cancer effect.

為了確定mRNA疫苗是否能通過誘導記憶T細胞分化來預防腫瘤復發或轉移，對初次mRNA疫苗接種后無瘤的小鼠重新接種結腸癌細胞（圖7a）。在mRNA疫苗處理組中，所有小鼠在重新接種后30天內均存活，而PBS處理的對照組小鼠存活率顯著降低（圖7b）。接種后54天，收集脾細胞和TILs進行IFN-γ ELISpot分析，確認mRNA疫苗誘導的抗原特異性免疫反應的持久性（圖7c）。此外，mRNA疫苗處理增加了脾臟和TILs中CD4+或CD8+T細胞的數量（圖7d和7e）。在接種后54天，mRNA疫苗處理的小鼠脾臟中Treg細胞（FoxP3+CD25+CD4+細胞）減少，同時效應記憶CD8+T細胞（CD44+CD62L-CD8+細胞）增加（圖7f,g），表明mRNA疫苗通過產生記憶T細胞維持長期免疫反應。此外，接種后94天，脾細胞中的新抗原特異性T細胞反應仍然存在（圖7h）。因此，mRNA疫苗接種在脾細胞和TILs中誘導了持續的MHC-I和MHC-II抗原特異性免疫反應。

Figure 7. mRNA vaccines prevent tumor recurrence and induced persistent MHC-I and MHC-II antigen-specific immune responses.

鑒于mRNA疫苗增加了免疫檢查點分子的表達，我們在結腸癌模型中進行了mRNA疫苗與ICIs的聯合治療。C57BL/6小鼠右側接種1×10^5個MC38結腸癌細胞后，分別在第3、8和11天給予200μg ICIs（抗小鼠PD-1和Tim-3抗體），在第7和10天給予10μg mRNA疫苗，或兩者聯合（圖8a）。值得注意的是，與對照組相比，mRNA疫苗和ICIs處理組的腫瘤生長顯著減少（圖8b,c）。聯合治療組的腫瘤生長抑制比單獨使用mRNA疫苗或ICIs更為顯著（圖8b,c）。此外，在聯合治療組中，三只小鼠的腫瘤消退，突顯了對腫瘤生長抑制的協同效應（圖8d,e）。

Figure 8. Combination therapy of mRNA vaccines with immune checkpoint inhibitors synergistically inhibits tumor growth.

本研究開發的mRNA基礎PCV平臺通過聯合遞送MHC-I和MHC-II限制性新抗原，展示了顯著的抗癌效果。該平臺不僅減少了術后復發，還通過與ICIs的聯合治療，顯著抑制了腫瘤生長。本研究通過聯合遞送MHC-I和MHC-II限制性新抗原，顯著增強了mRNA疫苗的抗癌效果。這一策略不僅激活了CD8+T細胞的直接殺傷作用，還通過CD4+T細胞的輔助作用，優化了抗腫瘤免疫應答。早期疫苗接種和與ICIs的聯合治療進一步提高了療效，為臨床應用提供了重要參考。

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參考文獻：Cho, Seongje, et al. "Rapid‐Turnaround Co‐Administration of mRNA‐Based MHC‐I and MHC‐II‐Restricted Neoantigens Enhances Immune Responses of Antigen‐Specific CD8+ T Cells and Anti‐Cancer Efficacy in Colorectal Cancer." Advanced Science (2025): e06426.